EFEITOS DO NITRATO E AMÔNIO APLICADOS VIA FOLIAR SOBRE NA EXTRUSÃO DE H+/OH- NA RIZOSFERA E NA NODULAÇÃO DO FEIJOEIRO (Phaseolus vulgaris)
EFFECTS OF NITRATE AND AMMONIA APPLIED TO FOLIAR ON EXTRUSION OF H + / OH-
IN RIZOSPHERE AND NODULATION OF BEAN
RICARDO ANTÔNIO TAVARES DE MACEDO
Doutor em Agronomia Fitotecnia pela Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
(UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil.
rizosferaagrociências@gmail.com
JORGE JACOB NETO
Docente na Agronomia Fitotecnia da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
(UFRRJ), Seropédica, RJ, Brasil.
j.jacob@globo.com
RESUMO
O nitrogênio (N) é um macronutriente essencial à sobrevivência e ao crescimento dos organismos vegetais, pois é um dos principais componentes das estruturas dos ácidos nucléicos, proteínas e clorofila, além de participar de diversos processos metabólicos da planta. Além da fixação biológica de N, o feijoeiro também pode obter o N das formas minerais nitrato e amônio. No entanto, é conhecido na ciência que estas fontes minerais promovem um efeito inibidor à nodulação e à FBN, e também provocam alterações no pH da rizosfera ao serem absorvidas pela planta. Considerando que a rizosfera das plantas supridas com fontes nítricas de N via foliar é alcalinizada e com fontes amoniacais de N via foliar é acidificada, este trabalho objetivou avaliar o efeito das alterações de pH rizosférico (pHR), causadas pelo metabolismo destas duas fontes minerais de N via foliar, na produção de nódulos radiculares.
Os resultados mostraram que, dentre as fontes de N mineral aplicadas via foliar, o amônio foi a fonte que mais acidificou a rizosfera e, também,
promoveu os maiores impactos negativos na nodulação do feijão (pHR 4,15 e 14 nódulos planta-1) em comparação com o nitrato (pHR 5,03 e 27 nódulos
planta-1).
Palavras chave: Balanço iônico. Nitrato. Amônio. Aplicação foliar. pH. Rizosfera. Rizóbio. Nodulação.
ABSTRACT
Nitrogen (N) is a macronutrient essential to the survival and growth of plant organisms, as it is one of the main components of the structures of nucleic acids, proteins and chlorophyll, besides participating in several metabolic processes in plants. In addition to the biological N fixation, the common bean can also obtain the N of the nitrate and ammonium mineral forms. However, it is known in science that these mineral sources promote an inhibitory
effect on nodulation and BNF, and also cause alterations in the pH of the rhizosphere when uptaked by the root plants. Considering that the rhizosphere of the plants supplied with nitric sources of N through the leaf is alkalinized and with ammoniac sources of N via foliar is acidified, this work aimed to evaluate the effect of rhizospheric pH changes caused by the metabolism of these two mineral sources of N leaf applied, in the production of root nodules.
The results showed that ammonium was the source that most acidified the rhizosphere and promoted the greatest negative impacts on bean nodulation (pH 4.14 and 14 plant-1 nodules) in comparison with nitrate (pHR 5.03 and 27 plant-1 nodules).
Key words: Ionic balance. Nitrate. Ammonium. Foliar application. pH. Rizosphere.Rizobium. Nodulation.
1 INTRODUÇÃO
O nitrogênio (N) é um dos principais componentes das biomoléculas, fazendo parte da estrutura de ácidos nucléicos, proteínas, clorofila, entre outros, e participando de processos metabólicos envolvidos no crescimento da planta, o que o torna um elemento essencial à sobrevivência e crescimento dos organismos vegetais (MACEDO, 2003). O nitrato (NO3 ‑) e o amônio (NH4 +) são as formas minerais de N absorvíveis pelas plantas e, no caso de espécies como o feijoeiro, existe também o processo de fixação biológica do N2 atmosférico (FBN) como fonte de N (HUNGRIA & KASCHUK, 2014;
LEAL et al., 2014; RIBEIRO et al., 2013; HUNGRIAet al., 1997).
O nitrato é absorvido ativamente, contra um gradiente de potencial eletroquímico da membrana plasmática, em um cotransporte (simporte) com prótons (MCCLURE et al., 1990). Após absorvido o nitrato pode sofrer ação das enzimas nitrato redutase e nitrito redutase e ser reduzido a amônio, pode ser armazenado no vacúolo ou pode ser exportado para a parte aérea pelo xilema (SANTOS, 2006). A absorção do amônio ocorre de forma passiva, a favor
de um gradiente de potencial eletroquímico da membrana, através de um transportador do tipo uniporte (SANTOS, 2006). O amônio é incorporado
à estrutura orgânica da planta (assimilado) através da formação inicial de glutamina, processo comum para o amônio proveniente da absorção (amônio mineral), da redução do nitrato ou da FBN. A síntese de glutamina é intermediada pela enzima glutamina sintetase (GS), onde o amônio é ligado ao grupo carboxílico do glutamato usando energia fornecida pelo ATP (SOUZA et al., 2002). A assimilação do amônio é finalizada com a produção de 2 glutamatos a partir da glutamina e do α-cetoglutarato, através da ação da enzima glutamato oxo-glutarato amônio transferase (GOGAT) e gasto de poder redutor.
Já a FBN, ocorre através da interação entre a planta fixadora e bactérias genericamente denominadas rizóbio, que quebra a tripla ligação do N2 atmosférico por meio da enzima nitrogenase, transformando-o em amônio no interior dos nódulos radiculares, e a planta fornece fotoassimilados como fonte de energia para o desenvolvimento e manutenção dos nódulos (HUNGRIA & KASCHUK, 2014; MAHON, 1979). Os primeiros passos da FBN envolvem diversos processos, onde o rizóbio necessita, antes de tudo, aproximar e colonizar a rizosfera (microrregião ao redor da raiz) para iniciar a
formação dos nódulos nas raízes. A planta exsuda na rizosfera compostos orgânicos, como os flavonóides no caso do feijoeiro (ARAÚJO et al., 1996), para atrair as bactérias por quimiotactismo (DROZDOWICZ, 1991). As bactérias se aderem aos pêlos radiculares e compostos químicos induzem à transcrição de genes de nodulação nas bactérias, conduzindo à síntese dos fatores Nod, moléculas de lipoquitooligossacarídeos responsáveis pelo reconhecimento
entre bactéria e a planta hospedeira (LIMPENS & BISSELING, 2003). Os fatores Nod induzem as várias respostas na planta, como o aumento da divisão celular no córtex radicular, deformação dos pêlos radiculares e a transcrição de genes relacionados à formação do nódulo (LIMPENS & BISSELING, 2003; FISHER & LONG, 1992). Com o nódulo formado, as bactérias mudam de forma e tamanho e perdem a motilidade, passando a se chamar bacteróides e fixar o N2 atmosférico. Embora o N seja um nutriente essencial às plantas, altas concentrações de N mineral no meio de crescimento da planta inibem a nodulação e a FBN (COLLINO et al., 2015; NOVA-FRANCO et al., 2015; REID et al., 2011; FERGUSON et al., 2013; JACOB et al., 1998; BANDYOPADHYAY et al., 1996; DENISON & HARTER, 1995; DUSHA et al., 1989; TANNER & ANDERSON, 1964).
Dentre os mecanismos inibitórios à nodulação devido às altas concentrações de N, uma das razões pode estar associada às alterações de pH ocorridas na rizosfera, considerando que o rizóbio apresenta alta sensibilidade às condições inadequadas de pH no solo e na rizosfera (FARIAS et al., 2016; ERGUSON & GRESSHOFF, 2015; FERGUSON et al., 2013; CAMPANHARO, 2006; VINUESA et al., 2003; ANDRADE et al., 2002; MIGUEL & MOREIRA, 2001; RIBEIRO JÚNIOR et al., 1987). As variações no pH rizosférico em plantas absorvendo N mineral ocorrem devido a um processo chamado balanço iônico vegetal (MC-NEAR JR., 2013, MARSCHNER, 2012, SHEN et al., 2012; RAVEN et al., 1990). Este processo está fundamentado na necessidade da planta
em compensar as cargas elétricas e em regular o pH celular, cujas variações internas estão relacionadas ao influxo de íons de diferentes cargas no citossol. O controle do pH citoplasmático, para que seja mantido em valores próximos a 7,3, é realizado por um sistema denominado “pH-stat”, que conta com a manutenção do pool de ácidos orgânicos que são carboxilados ou descarboxilados no interior da célula e está associado às trocas de prótons com o meio externo com a participação das H+-ATPases (HINSINGER et al., 2003).
Neste sentido, a geração de acidez ou alcalinidade na rizosfera é diretamente influenciada pela absorção de íons e ocorre pela absorção desigual de nutrientes catiônicos em relação aos aniônicos, quando expressos em equivalências de cargas (HAYNES, 1990). Como o N é o único o nutriente mineral absorvido como cátion (amônio) e ânion (nitrato), e por ser demandado em altas quantidades, a absorção destas duas formas de N promovem a acidificação e a alcalinização da rizosfera, respectivamente (MARSCHNER, 2012; RODRIGUEZ et al., 2008; CARVALHO et al., 2005; HINSINGER et al., 2003; JACOB NETO, 2003; RAVEN et al., 1990). É importante ressaltar que a FBN, assim como o amônio mineral, também gera acidificação da
rizosfera, cuja explicação também está baseada na necessidade da planta em equilibrar eletroquimicamente o meio intracelular. Neste caso, ao metabolizarem biologicamente o N2 atmosférico, que apesar de ser uma molécula neutra em relação à carga, as plantas absorvem do solo mais cátions do que ânions e, consequentemente, liberam na rizosfera excessos de cargas positivas em relação às negativas, gerando acidificação neste ambiente (TANG et al., 1997; ALLEN et al., 1988; JARVIS & ROBSON, 1983).
Considerando que o balanço iônico vegetal envolve a necessidade da planta em excretar na rizosfera excessos de cargas elétricas para regular-se internamente, a planta como um todo, entende-se que a aplicação de N via foliar também pode alterar o pH da rizosfera, especialmente considerando que no metabolismo do N na planta existe uma estreita relação entre as folhas e as raízes, estabelecida graças às translocações existentes entre estes dois órgãos da planta (GASSER et al., 2015). Neste sentido, diversas pesquisas indicam que produtos aplicados ou metabolizados nas folhas podem ser
translocados para as raízes, resultando em alterações das propriedades químicas e biológicas da rizosfera (IMPARATO et al., 2016; GASSER et al., 2015; LANE et al., 2012; SCAGEL, 2008; YILDIRIM et al., 2007; VRANY, 1974; VRANY, 1972; BEN ZIONI et al.; 1971; RAMACHANDRA REDDY, 1968; RAMACHANDRA REDDY, 1959; HALLECK & COCHRANE, 1950).Pesquisadores da área de microbiologia, por exemplo, verificaram a possibilidade de modificar a dinâmica microbiana da rizosfera através da aplicação foliar de produtos como fungicidas (HALLECK & COCHRANE, 1950), micronutrientes
(RAMACHANDRA REDDY, 1968) e ureia (VRANY, 1974; RAMACHANDRA REDDY, 1959). Mais recentemente cientistas observaram que o herbicida glifosato aplicado nas folhas também altera as condições químicas da rizosfera e a atividade microbiológica nesta região (IMPARATO et al., 2016; LANE et al., 2012).
Na nutrição nitrogenada, as inter-relações entre folhas e raízes estão demonstradas no modelo proposto por BEN ZIONI et al. (1971) para plantas de soja crescidas com nitrato. Após o metabolismo foliar, o malato produzido na folha com o uso da OH- resultante da redução do nitrato é transportado pelo floema, acompanhado de K+, para ser descarboxilado na raiz com a produção de HCO3 -, que pode ser liberado na rizosfera alcalinizando-a (TOURAINE
et al., 1992). No modelo de BEN ZIONI et al. (1971), o HCO3 – produzido na raiz é trocado por um novo nitrato, que é transportado para a parte aérea pelo xilema, também na presença de K+, estabelecendo-se assim um processo de redução de nitrato nas folhas controlado pela absorção de nitrato nas raízes. De acordo com SCAGEL (2008), a aplicação de ureia via foliar pode alterar a exsudação pelas raízes e, consequentemente, alterar também o pH da rizosfera (GASSER et al.; 2015) e a disponibilidade de nutrientes (YILDIRIM et al., 2007). Desta mesma maneira, no trabalho de VRANY (1972)
a aplicação de ureia via foliar em plantas de trigo cultivadas em um solo contaminado pelo fungo Fusarium sp. promoveu alterações químicas na rizosfera,
que resultou em impactos nas populações microbiológicas de fungos e bactérias desta região.
Considerando que o rizóbio que nodula o feijoeiro é sensível às condições inadequadas de pH na rizosfera, e que a aplicação via foliar das diferentes fontes minerais de N podem causar diferentes alterações no pH da rizosfera, local onde o rizóbio necessita aproximar-se e colonizar para formar nódulos, este trabalho objetivou avaliar a nodulação do feijoeiro suprido com diferentes fontes de N via foliar.
2 METODOLOGIA
2.1 Local de crescimento das plantas e preparo das sementes
Foram realizados 2 experimentos em câmara de crescimento instalada no Laboratório de Química da Rizosfera do Instituto de Agronomia da UFRRJ, sob iluminação com lâmpadas incandescentes e fluorescentes, taxa de luminosidade média de 400 Lux e fotoperíodo de 12/12 horas (luz/escuro). As paredes internas foram revestidas com papel alumínio e a temperatura foi constantemente controlada na faixa de 25ºC ± 2ºC com o uso de condicionador
de ar. As sementes de feijão da cultivar Ouro Negro foram padronizadas por tamanho e inoculadas com inoculante turfoso produzido pela Embrapa Agrobiologia contendo em torno de 108 células g-1 das estirpes BR-322 e BR-520 de Rhizobium tropici, com a inoculação feita no mesmo dia da semeadura. Foi feita uma pasta de inoculante com água destilada, aplicada de forma a recobrir toda a superfície das sementes, e em seguida as sementes foram conduzidas à secagem na sombra sob temperatura ambiente. No experimento 1 o feijoeiro foi cultivado em solução nutritiva para facilitar o monitoramento das variações de pH do meio externo às raízes do feijoeiro submetido às diferentes fontes de N aplicadas via foliar. No experimento 2 as
plantas de feijão, supridas com as mesmas fontes de N via foliar, foram cultivadas em vasos com areia, visando avaliar aos 10 DAE os valores de pH rizosférico e a produção de nódulos.
2.2 Experimentos
2.2.1 Experimento 1 (solução nutritiva)
Com o objetivo de estudar se a aplicação de fontes nitrogenadas via foliar nas plantas de feijão poderia alterar o pH da solução nutritiva, via liberação de OH-/H+ pelas raízes, este experimento foi instalado em um delineamento inteiramente casualizado com 5 fontes de nitrogênio (sem N, KNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3 e uréia – CO(NH2)2 ) e 4 repetições. Após a realização do teste de toxidez, devido à aplicação direta de N nas folhas, foi determinada a concentração de 1,35% de N para todas as fontes, correspondente à concentração de N em uma solução 3% de uréia, dose considerada de baixa toxidez ao feijoeiro (ALMEIDA et al., 2000). As sementes da cultivar Ouro Negro foram inoculadas e germinadas em areia lavada, posteriormente as plântulas aos 4 dias após a emergência foram fixadas em placas circulares de isopor e colocadas em vasos com 300 mL com a solução nutritiva ionicamente balanceada e constantemente aerada com o uso de compressores de aquário. Neste mesmo dia foi feita a aplicação única do N através de pulverização nas folhas cotiledonares que se já encontravam completamente abertas. As plantas foram isoladas completamente com algodão e papel alumínio no processo de pulverização foliar para não cair N na solução nutritiva. A solução nutritiva foi composta por 0,5 mM de K na forma de K2SO4;
0,5 mM de Ca na forma de CaCl2.2H2O; 0,5 mM de Mg na forma de MgSO4.7H2O; 0,5 mM de P na forma de NaH2PO4.2H2O; 10 μM de Fe na forma de FeNa-EDTA; 0,5 μM de B na forma de H3BO3; 0,4 μM de Mn na forma de MnSO4. H2O; 0,16 μM de Zn na forma de ZnSO4.7H2O; 0,04 μM de Cu na forma de CuSO4.5H2O; 0,04 μM de Co na forma de CoCl2.6H2O e 0,5 μM de Mo na forma de Na2Mo4.2H2O. Esta solução nutritiva foi adaptada da metodologia proposta por JACOB NETO (2003). Apesar da elevação da concentração de cálcio, magnésio e fósforo para 0,5 mM o equilíbrio de cargas da solução foi conservado. As leituras de pH da solução nutritiva foram feitas nos tempos de 14, 24, 40, 64, 88, 112, 136, 160 e 280 horas após a aplicação da solução nitrogenada do respectivo tratamento nas folhas.
2.2.2 Experimento 2 (vasos com areia)
Após a realização do experimento 1, onde foi verificado que a aplicação foliar altera o pH rizosférico e pode ser usada para separar o efeito do contato direto das fontes de N nas raízes da extrusão de OH-/H+ na rizosfera via metabolismo foliar, este experimento foi realizado no substrato areia com a aplicação do N também via foliar. Neste experimento a dosagem de N foi dividida em duas pulverizações foliares, aplicadas na concentração de 0,67%, aos 4 e 6 DAE. O delineamento experimental, tratamentos e número de repetições foram os mesmos do experimento 1. As plantas de feijão foram cultivadas
em potes de plástico sem drenagem com 230 g de areia. As sementes inoculadas foram posicionadas na região central do vaso e cobertas por uma camada de 1 cm de areia. A adubação dos vasos, exceto com N, foi realizada no mesmo dia da semeadura. Os cálculos para a massa de fertilizantes aplicados por
hectare foram feitos considerando uma camada de 20 cm de solo por hectare com massa de 2.000.000 de quilogramas, sendo a densidade considerada igual a 1 (um). A adubação de base, para todos os nutrientes menos o N, foi feita através de aplicações de 0,5 mL por vaso da solução de K2SO4 (0,5 M) e 1 mL por pote das soluções de CaCl2.2H2O (0,5 M), MgSO4.7H2O (0,5 M), NaH2PO4.2H2O (0,5 M), resultando nas massas de 170 kg de K ha-1, 174 kg de Ca ha-1, 104 kg de Mg ha-1 e 135 kg de P ha-1. Para os micronutrientes foi aplicado 1 mL por pote da solução estoque de micronutrientes, que foi preparada de acordo com a metodologia proposta por JACOB NETO (2003) com a seguinte composição: 2.302 mg/L de FeCl3.6H2O; 1.289 mg/L de EDTA; 31 mg/L de H3BO3; 67,6 mg/L de MnSO4.H2O; 45,92 mg/L de ZnSO4.7H2O; 9,96 mg/L de CuSO4.5H2O; 9,51 mg/L de CoCl2.6H2O e 121 mg/L de Na2Mo4.2H2O, resultando nas massas finais de 3.011 g ha-1 de Fe; 41 g ha-1 de B; 191 g ha-1 de Mn; 91 g ha-1 de Zn; 22 g ha-1 de Cu; 17 g ha-1 de Co e 417 g ha-1 de Mo. A irrigação foi feita constantemente através da aplicação de água destilada em quantidades suficientes para manter a areia apenas
úmida. Aos 2 dias após a emergência (6 dias após a semeadura) foi feito o desbaste, visando manter a plântula mais saudável de cada vaso e
a mais uniforme em relação às dos demais vasos. Foi realizada uma amostragem aos 10 DAE para avaliação do número de nódulos e o pH da rizosfera do feijoeiro.
